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QIAcuity數字PCR攜手LNA技術,實現基因突變精準檢測

瀏覽次數:10004 發布日期:2021-2-4  來源:凱杰生命科學
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據不完全統計,目前約有10000多種人類疾病是由基因突變引起的[1],其中癌癥是對人類威脅最為嚴重的疾病之一。據世界衛生組織國際癌癥研究機構 (IARC) 發布的2020年全球癌癥數據顯示,過去一年全球癌癥新發1929萬例,其中中國占23.7%;全球癌癥死亡的30.1%也發生在中國預防癌癥發生的最有效的辦法就是早發現、早預防、早治療。而基因突變作為引發癌癥發生的最重要因素之一,究其原因主要是基因突變誘導原癌基因的激活和抑癌基因的失活,從而導致細胞的過度增殖和免于細胞的凋亡[2]
 
稀有突變檢測是指在野生型背景池中僅檢測到1%甚至更低的突變體。所以,對于單堿基等稀有突變或單核苷酸多態性的檢測和量化,數字PCR憑借特有的樣品微反應單元分區技術,可以增加樣品的有效反應濃度,減少背景信號干擾,降低PCR抑制劑對PCR擴增效率的影響,從而實現特定核酸序列的更精準和更靈敏的檢測[3]
 
QIAGEN 2020年下半年重磅推出的QIAcuity一體化集成式納米微孔板數字PCR系統將微反應單元制備、PCR擴增和數據讀取集成到一臺全自動儀器中,整個流程最快2小時內完成QIAcuity采用專利納米微孔板利用微流體技術對微反應單元做物理分割,使分配到每個納米小孔中的反應液體積均一,無反應體系破裂融合或交叉污染,搭配特異性更高的QIAGEN LNA Mutation Assay,QIAcuity數字PCR系統為科學家們在稀有突變檢測領域中的應用提供了一個更好的選擇。
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QIAcuity數字PCR系統
 
QIAGEN在QIAcuity數字PCR平臺上開發并驗證了針對常見突變位點檢測的250組dPCR LNA Mutation Assay,該Assay的引物和探針都經過鎖核酸修飾來提高特異性及檢測靈敏度。探針可選擇FAM/HEX或Atto550/ROX雙標記不僅可實現野生型和突變型靶標分子的同時檢測更可在一管反應中進行多個靶標的檢測。所有突變位點均選自COSMIC數據庫,確保了突變位點研究的可靠性。
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dPCR LNA Mutation Assay
可同時檢測野生型和突變型靶標
 
所謂鎖核酸 (Locked Nucleic Acid,LNA) 技術,是將寡核苷酸序列中的β-D-呋喃核糖的2’-O,4’-C位通過縮水形成的剛性結構,增加引物和探針的Tm值,從而實現更短的引物和探針設計。在檢測稀有突變時,由于樣本濃度低并且在突變前后整個靶標分子的序列可能僅有單個堿基的差別,通過鎖核酸修飾的探針和引物增強了對互補序列的親和力和特異性。經過鎖核酸修飾的LNA Mutation Assay結合QIAcuity數字PCR平臺可以在野生型基因組背景下檢測到低于0.1%的突變體,對于液體活檢中的ctDNA和cfDNA的低頻突變檢測尤為適合。
 
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鎖核酸技術可實現更短序列引物或探針、更高Tm值
 
高靈敏度
 
QIAcuity數字PCR系統結合dPCR LNA Mutation Assay對不同梯度稀釋的腫瘤樣本進行檢測。數據顯示:檢測值與預期值一致性良好,突變頻率的檢測限達到了0.1%
 
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常見基因突變頻率預期與實際檢測結果比較
 
高精準度
 
QIAcuity數字PCR系統結合dPCR LNA Mutation Assay對已知突變頻率為0.1%的BRAF V600E基因進行檢測。數據顯示:檢測值為0.13%,相當于每個已知突變樣本中檢測到6拷貝的突變分子,與預期值0.1%幾乎一致實驗結果表明:數字PCR為檢測野生型背景下的突變DNA序列提供了高精準度的檢測方法;使用LNA增強的dPCR LNA Mutation的引物和探針,提高了檢測的特異性和精準度。
 
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使用dPCR LNA Mutation Assay對含BRAF V600E突變樣本檢測結果的二維散點圖

 

參考文獻:

[1] Dissected OMIM Morbid Map Scorecard (Updated June 26th,2020)
[2] Pothur R Srinivas,Barnett S Kramer,Sudhir Srivastava. Trends in biomarker research for cancer detection[J]. Lancet Oncology,2001,2(11).
[3] Basu, A. S. (2017). Digital assays part I: partitioning statistics and digital PCR. SLAS
TECHNOLOGY: Translating Life Sciences Innovation, 22(4), 369–386

 

上文所涉及產品僅適用于分子生物學應用。不可用于診斷、預防或治療疾病,未驗證其單獨使用或與其它產品合用后是否可用于此用途。

 

 

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