近日，美國明尼蘇達大學藥學院藥理學科學家，利用MFI，在權威雜志Journal of ControlledRelease（IF：7.901）發表文章：Freezing-induced Protein Aggregation - Role of pH Shift and Potential Mitigation Strategies, J Control Release. 2020 Jul 10;323:591-599.  

--研究背景--

在設計用于腸胃外給藥的蛋白質藥物產品中，聚集體的產生，除了在外觀上引起不適之外，最重要的是它們具有細胞毒性作用，或是引起機體免疫原性應答。美國和歐洲藥典對腸胃外藥物產品中的不溶性聚集物有規定：對于小劑量的腸胃外藥物，通過光阻法測量的小顆粒（≥10μm）和大顆粒（≥25μm）的推薦藥典規范分別為≤6000/container和≤600/container。
 

因此，預防和減輕蛋白質聚集對于維持蛋白質藥物產品的安全性，功效和質量至關重要。藥品加工步驟中，如純化，攪動，凍融，填充，凍干，制劑成分，運輸壓力，都有可能將天然蛋白質轉化為聚集體。而蛋白質溶液在配制為藥物產品之前，通常以冷凍狀態保存很長一段時間，所以，因反復凍融而產生的蛋白聚集體更應引起關注。

蛋白質制劑如緩沖液可確保制劑的pH值在整個保質期內都保持在所需范圍內。但在低溫過程中，某些緩沖區的有效性可能會受到影響。例如，當冷凍含有磷酸二氫鈉和磷酸二鈉的水溶液（即磷酸鈉緩沖液）時，磷酸氫二鈉的選擇性結晶導致冷凍濃縮液的pH降低，從而引起蛋白聚集體的產生。

因此，本文旨在研究，在不同緩沖溶液的凍融循環過程中，兩種模型蛋白質（牛血清白蛋白（BSA）和β-半乳糖苷酶（β-gal））聚集體的產生，以及這兩種蛋白對緩沖液pH值變化的影響。同時，評價了添加的非結晶溶質對pH值變化的影響，以及pH改變對蛋白質聚集行為的影響。

--研究結果--

使用MFI表征冷凍和解凍后蛋白顆粒的形成

利用MFI檢測發現，無論何種緩沖液，BSA（10mg/mL）在制備和立即分析時均顯示出最低的顆粒數。當這些溶液經受五個凍融循環時，在許多系統中顆粒數量都有小幅增加。但凍融循環在磷酸鈉緩沖液（100mM）中導致的顆粒計數增加顯著。加入纖維二糖（纖維二糖（一種還原糖）被用作模型非結晶溶質，一種冷凍保護劑）后，在磷酸鈉緩沖液（100mM）中導致的顆粒數有明顯緩解。

利用MFI檢測發現，β-gal（10mg/mL）在水中凍融后的顆粒數（〜100,000）急劇增加，表明該蛋白質對PH值的極端敏感性。同樣，β-gal在磷酸鈉緩沖液（100mM）中導致的顆粒計數增加顯著。加入纖維二糖后，在磷酸鈉緩沖液（100mM）中導致的顆粒數有明顯緩解。

低溫pH測定

將PBS和磷酸鈉（100mM）冷卻后，發現pH值變化幅度相似。當磷酸鈉濃度為10mM時，冷卻時的pH值變化不明顯。而蛋白質的添加（10mg/mL）可以降低了PBS和磷酸鈉（10mM）中pH值變化的幅度。當磷酸鈉濃度很高（100mM）時，蛋白質的作用就不那么明顯了，這表明，低蛋白濃度（10mg/mL）似乎不足以抑制緩沖鹽的結晶和隨之而來的pH偏移。

低溫XRD測定
 

研究結果發現，當將磷酸鈉緩沖溶液（10和100mM）冷卻時，在-15°C時Na₂HPO₄•12H₂O結晶明顯（分別參見圖4B和4C）。而BSA的添加，可以使Na₂HPO₄•12H₂O的峰強度降低，特別是在較低的緩沖液濃度（10mM）下更為明顯。這與觀察到的BSA對緩沖溶液pH值變化幅度的影響密切相關。此外，纖維二糖的添加完全抑制了緩沖鹽的結晶（圖4D），以及冰峰的強度也受到了抑制。這些結果揭示了非結晶溶質在蛋白質制劑中的附加作用。通過抑制緩沖鹽的結晶和隨之而來的pH值變化，這些賦形劑可防止蛋白質不穩定性。

熱分析

結果顯示，當將BSA添加到PBS中時，在-54.4℃出現玻璃化轉變溫度（Tg′），隨后在-22.4和0.1℃出現兩個吸熱峰。玻璃化轉變溫度反映了冷凍濃縮物組成發生了改變。BSA僅對100mM緩沖液的熱行為有明顯影響，導致Tg’（-47°C）和結晶溫度（-30°C）降低。同時，纖維二糖的添加有望改變冷凍濃縮物的成分，這在Tg’（-34°C）中有所體現。

結論：

磷酸鹽緩沖液被廣泛用于腸胃外蛋白質制劑中。但在冷凍過程中，磷酸氫二鈉（十二水合物）的選擇性結晶會降低冷凍濃縮液的pH值，從而導致蛋白質聚集。可以通過降低緩沖液濃度來最大程度地減小pH偏移。同時，BSA和β-gal可以通過對緩沖液結晶的抑制，減少pH的變化，但其作用程度要取決于緩沖液濃度。其它非結晶性賦形劑（纖維二糖）的添加，可通過抑制緩沖鹽結晶，來提高蛋白質的穩定性。