核糖體是細胞內最重要的細胞器之一。在生物體中DNA所包含的遺傳信息翻譯為蛋白質 的過程包括：首先DNA被轉錄為mRNA，而核糖體結合在mRNA上合成相應的蛋白質。真核 生物中核糖體的合成從核仁中開始，進一步在核仁和核質中加工成熟直至它們被運輸進入胞 質。這個過程涉及上百種核糖體生物合成因子，Rea1 AAA-ATP酶是核糖體生物合成中典型 的ATP酶。Rea1蛋白通過自身的6×ATP酶環狀結構域產生的機械力通過MIDAS和能與 MIDAS相互作用的結構域將核仁中60S前體上的Ytm1因子和核質中60S前體上的Rsa4因子 解離下來從而使核糖體60S大亞基能被運送入胞質。

在我們的研究中發現dek*是全新的玉米dek突變體。突變體呈現小而凹陷的籽粒表型， 并伴隨胚、胚乳、幼苗的發育滯后。通過對dek*的圖位克隆，發現dek*突變基因編碼玉米中 的Rea1蛋白，通過等位測試我們確定了這一結果。測序結果表明突變本質是編碼區的第 2359 個密碼子處發生單堿基突變導致所編碼氨基酸由丙氨酸（ GCG ）變為纈氨酸 （GTC）。該點突變導致了ZmRea1功能的減弱。而ZmRea1功能的減弱一定程度上抑制了核糖體大亞基的成熟及出核。我們的研究還表明dek*影響了不同mRNA的轉錄及翻譯調控，同時影響了基礎翻譯效率和細胞周期進程。


1. dek*是缺陷型籽粒突變體產生小而凹陷的籽粒，并伴隨發育滯后

授粉后15天的純合突變體籽粒呈現出小且扁的表型，而成熟的純合突變體籽粒由于周邊 野生型籽粒的擠壓變的小、凹陷和皺縮。百粒重發現dek*突變體籽粒相對于野生型顯著下降 39.85%。石蠟切片觀察發現胚的縱向切片顯示了胚芽以及胚根的發育相比較于野生型滯后 三天以上。野生型和突變體植株苗期都能生長正常。發芽后4天和7天幼苗突變體發育顯著滯 后于野生型。


2. Rea1的圖位克隆及等位測試

dek*基因被定位在第六號染色體大約101.6kb范圍內。在候選基因1中只有一個單個的核苷酸多態導致一個氨基酸的改變。等位測試確認了ZeRea1就是dek*基因。定量PCR與 Western雜交實驗確認了ZeRea1在突變體籽粒中表達量的下降。


3. Rea1蛋白在不同物種中高度保守且組成型表達

進化樹的分析結果顯示玉米中Rea1蛋白與其它植物中該蛋白是高度保守的，與酵母、 哺乳動物和微生物中該蛋白也有一定的保守性。定量RT-PCR分析揭示了ZmRea1在玉米的 各個組織中廣泛表達，包括花絲、雄穗、果穗、根、包衣、莖、葉以及籽粒。將總的核蛋白 及胞質蛋白分離后用Rea1多克隆抗體對這兩個組分進行點雜，來檢測Rea1蛋白的分布。結 果顯示Rea1只在核蛋白組分中，表明Rea1定位在細胞核中。


4. rea1突變體影響了60S大亞基的成熟及出核

蔗糖密度梯度離心分析了突變體和野生型籽粒核糖體的分布情況。分析結果顯示和40S 核糖體亞基相比，突變體的60S核糖體亞基相較于野生型顯著下降。免疫雜交顯示，突變體 和野生型籽粒在核蛋白和胞質蛋白中幾乎無差別。

透射電鏡發現突變體胞質中60S核糖體大亞基的減少。突變體中粗面內質網上以及蛋白 體周圍的粗面內質網上的核糖體數量相較于野生型有顯著下降。這些結果都一致表明突變體 中60S大亞基出核受到影響，且為特異性影響60S大亞基的成熟及輸出路徑而對40S小亞基 的成熟未造成影響。

5. rea1基因影響核糖體合成、翻譯延伸及細胞周期相關基因的表達

RNA-seq轉錄組分析篩選出的差異基因共有2076個。在這2076個基因中GO路徑分析顯 示有功能注解的828個差異表達基因主要與3個GO terms相關GO: 0005840 (核糖體, p- value=2.34E-130), GO: 0006414 (翻譯延伸, p-value=2.30E-17) 和GO: 0000786 (核仁, p-value= 8.22E-29)。      

為了進一步證實通過RNA-seq觀察到的突變體和野生型胚乳差異表達基因，我們從每個 分類中挑選了最顯著的差異表達基因進行定量RT-PCR，結果顯示出與RNA-seq相似程度的 mRNA積累差異。

6. rea1中不同mRNA的翻譯調控

mRNA多聚核糖體化的水平和其翻譯水平是極其一致的。為了檢測突變體對mRNA翻譯 調控的影響，我們全面評估了15DAP突變體和野生型籽粒中核糖體復合體中所結合的轉錄 本總量與所有基因轉錄本總量的對比情況。突變體和野生型15DAP玉米籽粒中多聚核糖體 結合的RNA和總RNA的比值分別為36.41% 和25.57%，突變體比野生型提高了1.42倍，這 個結果與通過A254吸收峰分析的多聚核糖體復合物與總核糖體的比值結果一致。

7. rea1影響胚乳內擴增的細胞周期

流式細胞分析授粉后15天突變體和野生型玉米籽粒胚乳細胞，結果顯示突變體中倍型大 于等于12C占總比例的18.08%，而野生型的占比為26.18%。在授粉后18天的玉米籽粒胚乳 細胞中突變體細胞核倍型大于等于12C占總比例的19.25%而野生型為24.22%。這些結果表 明dek*突變體中胚乳細胞內擴增的細胞周期進程受到影響最終導致籽粒的發育滯后。

該研究中，ZmRea1轉錄組RNA-seq服務由上海伯豪生物技術有限公司提供。

原文出處：W Qi, J Zhu, Q Wu, Q Wang , X Li , D Yao , Y Jin , G Wang , G Wang , and R Song Maize rea1 mutant stimulates ribosome use efficiency and triggers distinct transcriptional and translational responses Plant Physiology 2015 (published online)