背景介紹

     在神經網絡中，外部刺激通過背根神經節（Dorsal root ganglion，DRG）的假單極感覺神經元（Pseudo-unipolar sensory neurons）傳遞到脊髓（Spinal cord）中。小的DRG可以通過無髓鞘的軸突（Un myelinated axons，C-fibers）和薄髓鞘的軸突（thinly myelinated axons，Aδ-fibers）傳遞從神經末梢（Peripheral nerve terminals）發生的疼痛感、溫度和機械感受信號至脊髓的I-II層。大的DRG則通過厚髓鞘的軸突（thickly myelinated axons，Aβ-fibers）傳遞機械感受信號和本體感覺信號至脊髓的III-V層。DRG在信號傳遞的過程中發揮了重要的作用。盡管在之前文獻中，已經有通過芯片和RNA測序的手段對DRG的基因表達有所研究，并且鑒定到了一些神經調節物質（Neuromodulators）的表達，如：尿鈉排泄肽B（Natriuretic peptide B，NPB）和Na+，K+-ATPase（NKA），但卻并沒有對單個神經元提供全方位的轉錄組表達情況的介紹。

     最近，有多個工作已經對DRG神經元的轉錄情況進行了分析，如：TRPV1世系和Nav1.8通道表達DRG神經元的RNA-seq。在單細胞測序（Single-cell RNA-seq）方面，Chiu等鑒定到了6個DRG神經元的亞家族。相比于普通的轉錄組測序，單細胞測序可以使人們對單一細胞的轉錄組測序有更深入的了解。在神經生物學的研究中，由于神經元相對其他組織細胞而言具有高度的異質性（Heterogeneity），因此普通轉錄組測序不能夠滿足人們對神經細胞轉錄水平的研究。單細胞測序可以逐個對單個細胞進行轉錄水平的分析，因此在神經生物學的研究中具有廣泛的應用。Usockin等按照傳統模式，對小鼠DRG進行的低覆蓋度的單細胞測序將DRG分為了11個不同類型。雖然這些工作對感覺神經元的研究有重要意義，但是卻并不全面。

    上海生命科學院神經科學研究所張旭院士聯合生物芯片上海國家工程研究中心、上海生命科學院生物化學與細胞研究所、上海科技大學以及徐匯區中心醫院利用高覆蓋度的單細胞測序技術以及體內膜片鉗（in vivo patch clamp）技術，按照轉錄模式、分子標記以及功能注釋將小鼠DRG分為了10個大類和14個小類，還發現了一個新的軀體感覺受體種類。作者還認為目前對分子功能以及信號網絡和轉錄組數據可以部分的預測不同神經元的功能。該成果已經發表在了2015年12月的國際著名期刊Cell Reasarch（影響因子11.981）上。該研究中單細胞測序服務由上海伯豪生物技術有限公司提供。

1. 神經元樣本和轉錄組數據質控

    研究人員首先利用融合IB4的CGRP，NF200熒光標記物對神經元進行免疫染色（Immunostaining）。結果表明，～35%的神經元能被IB4染色，～41.2%被CGRP染色，～46.4%被NF200染色（圖1A）。大約20%被IB4染色的神經元能夠表達CGRP，然而只有5.6%表達NF200。大約28%被CGRP染色的神經元表達NF200。極少數可以同時被三個染色。

    為了提高對神經元細胞分類的效率，研究人員設計了一個專門針對DRG分類的方法。首先，DRG細胞被從小鼠體內分離出后再利用IB4對其染色（圖1B）。顯微鏡下，那些周圍沒有衛星細胞的被選擇用來進行轉錄組測序。測序文庫一共來源于19個小鼠的203個神經元。

    為了獲得可靠的單神經元轉錄組數據，研究人員首先通過預實驗對測序的深度和檢測基因數量進行分析，并且確認了在維持測序質量的前提下，每個樣本至少3000萬的reads作為合理的最小測序量。最終，研究人員每個樣本的平均測序量達到了5820萬（2960萬－1.064億）（圖1C）。檢測到的基因數量范圍在7972-13960個之間（圖1D）。為了評估測序深度和基因數量之間的關系，研究人員還對其中6個文庫進行了重新測序，平均測序量達到了1.81億個reads。結果發現，和深度測序相比，同一文庫的相似度為99.8%（圖1E）。

     最后，為了確認RNA-seq的質量，研究人員將同一文庫的cDNA等量分成兩份再一次進行了RNA-seq，兩次測序的匹配度達到了99.4%。

2. 基因共表達網絡鑒定基因模塊（Gene module）

    研究人員對197個單細胞測序數據進行了關聯分析。基因共表達網絡分析（Weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）常被用于對有關聯的基因進行模塊分類。由于在該分析模式下，同一個細胞簇中有著高度關聯的基因，因此這對細胞分類頗為有用。使用WGCNA方法，研究人員在2043個差異表達基因中鑒定到了12個基因模塊（圖1G）。

      原位雜交（In situ hybridization, ISH)實驗確認了該結果的可靠性（圖1H）。

3. 基于神經元大小的分級成簇分析（Neuron size-based hierarchical clustering）揭示了10個細胞簇

    研究人員還將197個神經元中1745個差異表達基因進行基本的分析來對神經簇進行歸類（圖2A），一共將其分為10個種類，分別為C1-C10。基于對1745個差異基因的細胞－細胞關聯矩陣（cell-cell correlation matrix）分析，C9神經元被認為高度關聯(value of Spearman correlation (VSC): 0.780±0.007) 。 

圖1:神經元樣本，RNA測序以及基因分類

4. 14個神經元亞簇和雜交狀態

      根據簇的分類，C1，C2，C4，C5，C，C8以及C9還可以被分為兩個亞簇，總共14個亞簇（圖2A，3A）。以C4為例，C401表達Mrgpra3基因，而C4-2同時表達Mrgpra3基因與Mrgprb4基因。單細胞定量PCR以及原位雜交實驗同樣確認了C4-2的存在（圖3B-D）。Mrgpra3基因與Mrgprb4基因盡管同在C4-2中被檢測到，但共表達網絡卻沒有任何交集（圖3E）。

5. 神經元簇中的差異基因

    研究人員使用了Fisher檢測來鑒定神經元簇和亞簇中的差異基因。結果發現，C1包含了高表達的Tac1和Calca基因，然而C2中Nppb有高表達。C1與C2的比較中發現了152個差異表達的基因，其中83個在C1中高表達。另外，研究人員還對其余的神經元簇和亞簇進行了差異基因的分析。

6. 神經元簇的標志物

    一個合格的標志基因的先決條件需要具備可選擇性，高表達以及可實驗性。Gal，Nppb，Th以及Mrgpra3被認為是C1，C2，C3和C4的標志物（圖4A）。每個簇可以有多個標志物，如Nts，Il31ra以及Htr1f同時作為C2的標志物（圖4B），Cadps2，Baiap2l1和Necab2同時作為C9的標志物（圖4C）等等。原位雜交實驗確認了該結果的準確性（圖4F，G）。

7. 神經元簇的功能表型

   研究人員為了確認鑒定的14個神經元亞簇具有不同的生物學功能，還對其進行了各個條件的無差異性分析（圖5），確認了不同神經元亞簇在接受信號過程中表現出不同的表型具備不同的功能。

原文出處
Li CL, Li KC, Wu D, Chen Y, Luo H, Zhao JR, Wang SS, Sun MM, Lu YJ, Zhong YQ, Hu XY, Hou R, Zhou BB, Bao L5, Xiao HS, Zhang X. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity.Cell Res. 2015 Dec 22.